남태평양 Micronesia Chuuk에 서식하는 흑진주조개 (Pinctada margaritifera) 난 단백질의 다클론항체 개발

Abstract

◎ 연구의 배경 및 목적 : 흑진주조개, Pinctada margaritifera 양식은 남태평양 도서 국가에서 가장 중요한 산업 중 하나이다. 흑진주 생산량 증가는 흑진주조개 모패 수요를 급격히 증가시켰으며, 이는 흑진주조개 자원량의 감소를 야기 하였다. 흑진주생산을 위한 모패의 안정적 공급은 진주양식 산업에 있어 가장 시급한 일 중의 하나로 간주된다. 따라서 흑진주조개 치패의 안정적 공급을 위하여 인공종묘생산을 통한 치패의 필요성이 높게 인식되고 있으나, 생활사 및 번식생리 등에 관한 기초연구 부족으로 흑진주 조개의 인공종묘생산은 아직 이루어지지 않고 있다. 해산이매패류의 생식 주기 파악 및 산란시기 예측과 같은 정성적인 연구와 포란수 측정 등은 이들의 양식 관리하는데 있어 중요한 기초 자료가 된다. 이매패류는 알을 포함하는 생식소가 물리적으로 분리되지 않고 외투막 및 소화맹낭에 포함되어 있어 번식량 측정 연구의 어려움이 있다. 그러나 알 단백질에 대한 특정 항체를 개발, 항체면역효소측정법 (ELISA)을 이용하면 이러한 문제점을 해결할 수 있으며, 이매패류의 정량적인 번식량 측정이 가능하다. ◎ 재료 및 방법 : 성숙한 흑진주조개로부터 알을 분리하여 동결건조 한 후 실험에 사용될 때까지 -70℃에 보관하였다. 정량적인 번식량 측정에 사용할 항체를 개발하기 위해 0.5 mg/ml (in PBS, pH 7.4) 난 단백질과 동일량의 Freund's Complate Adjuvant (FCA)를 혼합하여 토끼의 등 피하에 주사하였다. 이후 8주에 걸쳐 동일한 항원 단백질과 Freund's Incomplate Adjuvat (FIA)를 혼합하여 총 5차례 booster를 실시하였다. 8주후 토끼로부터 미량의 혈액을 채취하였고, 혈청 분리 후 Haemagglutination test (HA test)로 개발 중인 항체 역가를 결정하였다. 이후 난 단백질 이외의 비 특정 세포와 교차반응을 확인하기 위하여 Double immunodiffusion test 및 ELISA를 이용해 확인하였다.◎ 결과 및 고찰 : 최초의 항원 단백질 주사로부터 8주 이후에 채취된 토끼의 혈청으로 HA test 실시 결과, 흑진주조개의 난 단백질 항체 역가는 1,200배까지 희석이 가능한 민감도를 나타냈다. ELISA 분석을 위해 흑진주 조개 난 단백질 (23ug/ml)과 negative control인 수컷 개체 조직 단백질 (25ug/ml)이 항원으로 사용되었다. ELISA 과정 중, 이 실험에서 개발중인 흑진주조개의 난 특이단백질 혈청 (항체)을 1차 &