4,5-Diamino-fluorescein diacetate (DAF-2DA)을 이용한 담치, Crenomytilus grayanus의 Nitric oxide정량

Abstract

혈구는 해산연체동물의 면역 반응을 일으키는 중요한 세포로 자극시 oxygen radical과 nitrogen radical 을 분비하여 생체방어에 이용한다. 척추동물의 nitrogen radical의 일종인 일산화질소 (nitric oxide, NO) 는 주로 대식세포의 효소인 nitric oxide synthase (NOS) 에 의해 L-arginine를 이용하여 합성되어 생체내에서 cytokine, bacterial lipopolysaccharide (LPS) 또는 기생충 등과 반응하여 항균작용, 면역조절, 염증유도 등의 역할을 한다. NOS는 isoform인 endothelial NOS (eNOS), inducible NOS (iNOS) 및 neuronal NOS (nNOS) 로 구성되며, eNOS와 nNOS는 세포내에서 극소량으로 존재하나, iNOS에 의해 발생하는 NO는 염증유발 물질에 의해 대량으로 발생 한다. 담치에서의 NO 측정에 관한 연구는 LPS, β-glucans 또는 phorbol-myristate acetate (PMA)에 노출되거나 중금속인 Cd에 노출되었을 때, 기생충 감염시 혈림프에서 NO 농도의 증가가 나타남으로써 병원성 물질의 침입이나 중금속과 같은 외부 침입성 비자기 물질에 대한 반응에 따라 NO 생성의 변화가 측정되고 있다. 이러한 사실은 NO 생성이 생물의 생리학적·병리학적 특성에 따라 민감하게 반응하며, 따라서 NO 량의 변화는 생물의 생리적 특성을 진단하는데 중요한 인자로 판단된다. NO는 반감기가 수초에 불과한 기체로 주로 세포내에 존재하나 일부는 세포외로 유리되어 이산화질소로 산화되거나 아질산염과 질산염으로 분해된다. 아직까지 무척추동물의 NO정량은 세포외로 유리된 NO의 누적량을 측정하는 Griess assay가 주로 이용되어 왔다. 최근 DAF assay는 4,5-Diamino-fluorescein diacetate (DAF-2DA) 가 esterase에 의해 DAsynthase (NOS) 에 의해 L-arginine를 이용하여 합성되어 생체내에서 cytokine, bacterial lipopolysaccharide (LPS) 또는 기생충 등과 반응하여 항균작용, 면역조절, 염증유도 등의 역할을 한다. NOS는 isoform인 endothelial NOS (eNOS), inducible NOS (iNOS) 및 neuronal NOS (nNOS) 로 구성되며, eNOS와 nNOS는 세포내에서 극소량으로 존재하나, iNOS에 의해 발생하는 NO는 염증유발 물질에 의해 대량으로 발생 한다. 담치에서의 NO 측정에 관한 연구는 LPS, β-glucans 또는 phorbol-myristate acetate (PMA)에 노출되거나 중금속인 Cd에 노출되었을 때, 기생충 감염시 혈림프에서 NO 농도의 증가가 나타남으로써 병원성 물질의 침입이나 중금속과 같은 외부 침입성 비자기 물질에 대한 반응에 따라 NO 생성의 변화가 측정되고 있다. 이러한 사실은 NO 생성이 생물의 생리학적·병리학적 특성에 따라 민감하게 반응하며, 따라서 NO 량의 변화는 생물의 생리적 특성을 진단하는데 중요한 인자로 판단된다. NO는 반감기가 수초에 불과한 기체로 주로 세포내에 존재하나 일부는 세포외로 유리되어 이산화질소로 산화되거나 아질산염과 질산염으로 분해된다. 아직까지 무척추동물의 NO정량은 세포외로 유리된 NO의 누적량을 측정하는 Griess assay가 주로 이용되어 왔다. 최근 DAF assay는 4,5-Diamino-fluorescein diacetate (DAF-2DA) 가 esterase에 의해 DAF-2로 변형된 후 세포가 생성하는 NO와 선택적으로 반응하여 Triazolo-fluorescein (DAF-2T) 라는 형광물질이 되는 원리를 이용하여 실시간으로 세포내에 NO에 의해 생성되는 형광량을 화상분석 (image analysis) 이나 형광분광기 (fluorescent spectrophotometer), 또는 유세포 분석기(flow cytometer) 를 정량할 수 있는 기술이 알려지고 있다. 따라서 본 연구에서는 DAF-2DA를 이용하여 담치혈구 세포의 NO생성을 1mM L-arginine과 그 유사체인 1mM Nω-Nitro-L -arginine methyl ester hydrochloride (L-NAME)를 각각 노출시켜 up regulation과 down regulation 되도록 조절한 뒤, 이를 DAF-2DA와 반응 후 현광분석기를 이용하여 측정하였다.L-arginine에 노출 된 혈구세포는 대조구에 비해 높은 NO생성을 나타내었으며, L-NAME에 노출 된 혈구 세포는 대조구에 비해 낮은 NO생성이 나타나는 것으로 측정되었다. 이를 결과를 통해 DAF-2DA와 반응 후 현광분석기를 이용하여 담치의 NO생성량 측정이 가능함을 확인하였다. 이 연구를 통해 얻은 기술은 담치의 NO생성 측정기술은 화상분석이나 형광분광기, 또는 유세포 분석기를 이용하여 실시간으로 NO생성을 측정하는데 유용하게 사용될 수 있을 것이며, 이러한 정보는 담치의 생리학적·병리학적 특성에 관한 연구에 유용한 지표가 될 것으로 사료 된다.